|
|
|
| |
Главная >> Медицинские статьи >> Лабораторная диагностика
Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостяхАлехин С.А. Липатов В.А. Курский государственный медицинский университет, каф. хирургических болезней № 2, каф. оперативной хирургии и топографической анатомии www.drli.h1.ru
Определение активности трипсина является важным критерием в диагностике острого панкреатита. До настоящего времени основным методом определения активности трипсина был метод Эрлангера в модификации Шатерникова. Недостатками данного метода является его большая стоимость, погрешность связанная с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности стандартного раствора р-нитроанилина от его концентрации используемого для построения калибровочного графика, сложность расчетов.
Целью нашей работы являлось устранение вышеизложенных недостатков существующей методики.
Нами разработан микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях.
Метод основан на расщеплении трипсином синтетического бесцветного субстрата — бензоиларгинин-р-нитроанилида — с образованием окрашенного р-нитроанилина, количество которого мы определяем на спектрофотометре BACKMAN-DU65 c микрокюветами при длине волны 410 нм.
Реактивы используемые в нашем методе такие, как и в методике Эрлангера в модификации Шатерника.
Калибровка проводится по описанной методике отличием является построение графика, которое проводится для автоматизации процесса и ведения базы данных в Microsoft Excel.
Поскольку калибровочный график не может иметь четкую линейную зависимость, то для выражения зависимости оптической плотности раствора от концентрации р-нитроанилина необходимо определить уравнение которое описывает данную график. Таким уравнением является уравнение полиномиальной аппроксимации, которое можно также вывести на калибровочный график в Microsoft Excel.
Ход определения: В опытную и контрольную пробирку вносят по 0,4 мл бензоиларгинин-р-нитроанилида и добавляют по 0,025 мл физиологического раствора. Затем вносят по 0,025 мл плазмы крови, в контрольную пробирку сразу после этого добавляют 0,05мл 0,5н раствора НCl. 0,5 мл содержимого помещают в микрокювету и измеряют значение оптической плотности при длине волны 410 нм и обозначают это значение, как ЕК(410). Поскольку в некоторых случаях в ходе ферментативной реакции происходит помутнение раствора, для введения поправки на мутность следует определить оптическую плотность жидкости также и при длине волны 550 нм. Полученные данные помечают как ЕК(550). Далее опытную пробирку ставят в термостат при температуре 370С на 30 минут. После термостатирования определяют оптическую плотность раствора при длинах волн 410 и 550 нм в опытной пробирке и помечают полученные данные, как ЕОп(410) и ЕОп(550).
Расчет активности трипсина производят в три этапа 1. Расчет разницы оптических плотностей при разных длинах волн, она будет равна: DЕ = (ЕОп(410) – ЕК(410)) – (ЕОп(550)- ЕК(550))
2. Расчет количества образовавшегося р-нитроанилина по полиномиальному уравнению, которое в общем виде будет выглядеть следующим образом:
y = b + c1*x + c2*x2 +……. +c6*x6 , где b и с константы
Пример полиномиального уравнения для расчета концентрации р-нитроанилина: y = 874,45*x 1 + 84,94*x2 В данном случае константа b равняется 0 и в связи с этим опущена. х - DЕ, а у – количество образовавшегося р-нитроанилина.
В каждой лаборатории должна быть проведена калибровка и расчет полиномиального уравнения для данных этой калибровки.
3. Непосредственно расчет активности трипсина.
Поскольку это микровариант методики определения трипсина, количества реактивов и плазмы крови пропорционально уменьшены по отношению к классической методике, то и коэффициенты перерасчета будут теми же, что и в классической методике.
Количество р-нитроанилина высчитанное с помощью полиномиального уравнения, показывает сколько вещества образовалось в ходе ферментативной реакции в 0,5 мл субстрата в течение 30 минут при добавлении 0,025 плазмы, а высчитываемое количество трипсина в единицах активности показывает сколько вещества образуется в 0,5 мл субстрата при добавлении 0,1 мл плазмы за 1минуту.
Следовательно А – количество трипсина в единицах активности будет равно: А = (у * 4) / 30. Таким образом расчет активности трипсина по данной методике значительно снижает расход реактивов (в 10 раз по сравнению с методикой Эрлангера в модификации Шатерникова) очевидна экономическая эффективность первой из них. В связи с отсутствием принципиальных отличий между двумя методиками, результаты измерений активности трипсина будут аналогичными (разница между результатами будет находится в области погрешности методики). Немаловажным является и снижение количества забираемой крови на исследование. Так по предложенной нами методике плазмы необходимо всего 0,05 мл. а по классической методике 0,5 мл. Использование автоматических микропипеток позволяет уменьшить погрешность связанную с работой с микроколичествами реактивов и биологических материалов. Еще одним положительным моментом нашей модификации является упрощение расчетов и построения калибровочного графика и их автоматизация. Использование уравнения полиномиальной аппроксимации позволяет снизить погрешность методики связанную с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности раствора р-нитроанилина от его концентрации. В целом методика расчета более проста для понимания, чем классическая, а использование Microsoft Excel позволяет не только полностью автоматизировать расчет, но и вести базу данных.
Алехин С.А., Липатов В.А. Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях. // Материалы 66-й научной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные проблемы медицины и фармации", Курск, 2001, -с. 57 - 59. 18.05.2004
Смотрите также: Аллергические реакции на яд перепончатокрылых насекомых, Диатез, Алкоголизм? Есть Выход, Растительный иммуностимулирующий препарат - Иммунал. Перспективы применения в медицине, Как я имитирую оргазм Интересные факты:
Активный регулируемый дренаж для профилактики ближайших послеоперационных осложнений при эхинококкозе головного мозга Т.М.Оморов. Кыргызская Государственная Медицинская Академия, г.Бишкек,Кыргызская Республика.
| Шок Шок - общая реакция организма на воздействие сверхсильных травмирующих раздражителей, которая проявляется расстройством и угнетением основных систем жизнеобеспечения организма (кровообращения, дыхания, нервной, эндокринной). В большинстве случаев шок представляет серьезную опасность для жизни. В зависимости от причин, вызвавших это состояние, различают следующие виды шока: травматический, кардиог
| Здоровая пища делает людей счастливыми Как известно, здоровая пища - один из ключевых компонентов здорового образа жизни, без которого невозможно избежать болезней. Но, оказывается, правильное питание помогает человеку не только оставаться физически здоровым, но и быть веселым и жизнерадостным.
| Артериальная гипертензия в подростковом возрасте Г.Г.Бахтина Детский кардиолог «Центра Новых Медицинских Технологий в Академгородке», врач высшей категории, к.м.н.
| Азитрал® (азитромицин) в комплексном лечении урогенитального хламидиоза у мужчин Профессор В.А. Молочков МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского Урогенитальный хламидиоз – наиболее распространенная инфекция, передаваемая половым путем (ИППП). Начавшаяся в 1993 году регистрация урогенитального хламидиоза в России выявила ежегодное удвоение случаев этой инфекции, и к 2000 году урогенитальный хламидиоз, по официальной статистике, вышел на 3–е место после трихомониаза
|
| |
|