|

|
|
 | |
Главная >> Медицинские статьи >> Лабораторная диагностика
Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостяхАлехин С.А. Липатов В.А. Курский государственный медицинский университет, каф. хирургических болезней № 2, каф. оперативной хирургии и топографической анатомии www.drli.h1.ru
Определение активности трипсина является важным критерием в диагностике острого панкреатита. До настоящего времени основным методом определения активности трипсина был метод Эрлангера в модификации Шатерникова. Недостатками данного метода является его большая стоимость, погрешность связанная с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности стандартного раствора р-нитроанилина от его концентрации используемого для построения калибровочного графика, сложность расчетов.
Целью нашей работы являлось устранение вышеизложенных недостатков существующей методики.
Нами разработан микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях.
Метод основан на расщеплении трипсином синтетического бесцветного субстрата — бензоиларгинин-р-нитроанилида — с образованием окрашенного р-нитроанилина, количество которого мы определяем на спектрофотометре BACKMAN-DU65 c микрокюветами при длине волны 410 нм.
Реактивы используемые в нашем методе такие, как и в методике Эрлангера в модификации Шатерника.
Калибровка проводится по описанной методике отличием является построение графика, которое проводится для автоматизации процесса и ведения базы данных в Microsoft Excel.
Поскольку калибровочный график не может иметь четкую линейную зависимость, то для выражения зависимости оптической плотности раствора от концентрации р-нитроанилина необходимо определить уравнение которое описывает данную график. Таким уравнением является уравнение полиномиальной аппроксимации, которое можно также вывести на калибровочный график в Microsoft Excel.
Ход определения: В опытную и контрольную пробирку вносят по 0,4 мл бензоиларгинин-р-нитроанилида и добавляют по 0,025 мл физиологического раствора. Затем вносят по 0,025 мл плазмы крови, в контрольную пробирку сразу после этого добавляют 0,05мл 0,5н раствора НCl. 0,5 мл содержимого помещают в микрокювету и измеряют значение оптической плотности при длине волны 410 нм и обозначают это значение, как ЕК(410). Поскольку в некоторых случаях в ходе ферментативной реакции происходит помутнение раствора, для введения поправки на мутность следует определить оптическую плотность жидкости также и при длине волны 550 нм. Полученные данные помечают как ЕК(550). Далее опытную пробирку ставят в термостат при температуре 370С на 30 минут. После термостатирования определяют оптическую плотность раствора при длинах волн 410 и 550 нм в опытной пробирке и помечают полученные данные, как ЕОп(410) и ЕОп(550).
Расчет активности трипсина производят в три этапа 1. Расчет разницы оптических плотностей при разных длинах волн, она будет равна: DЕ = (ЕОп(410) – ЕК(410)) – (ЕОп(550)- ЕК(550))
2. Расчет количества образовавшегося р-нитроанилина по полиномиальному уравнению, которое в общем виде будет выглядеть следующим образом:
y = b + c1*x + c2*x2 +……. +c6*x6 , где b и с константы
Пример полиномиального уравнения для расчета концентрации р-нитроанилина: y = 874,45*x 1 + 84,94*x2 В данном случае константа b равняется 0 и в связи с этим опущена. х - DЕ, а у – количество образовавшегося р-нитроанилина.
В каждой лаборатории должна быть проведена калибровка и расчет полиномиального уравнения для данных этой калибровки.
3. Непосредственно расчет активности трипсина.
Поскольку это микровариант методики определения трипсина, количества реактивов и плазмы крови пропорционально уменьшены по отношению к классической методике, то и коэффициенты перерасчета будут теми же, что и в классической методике.
Количество р-нитроанилина высчитанное с помощью полиномиального уравнения, показывает сколько вещества образовалось в ходе ферментативной реакции в 0,5 мл субстрата в течение 30 минут при добавлении 0,025 плазмы, а высчитываемое количество трипсина в единицах активности показывает сколько вещества образуется в 0,5 мл субстрата при добавлении 0,1 мл плазмы за 1минуту.
Следовательно А – количество трипсина в единицах активности будет равно: А = (у * 4) / 30. Таким образом расчет активности трипсина по данной методике значительно снижает расход реактивов (в 10 раз по сравнению с методикой Эрлангера в модификации Шатерникова) очевидна экономическая эффективность первой из них. В связи с отсутствием принципиальных отличий между двумя методиками, результаты измерений активности трипсина будут аналогичными (разница между результатами будет находится в области погрешности методики). Немаловажным является и снижение количества забираемой крови на исследование. Так по предложенной нами методике плазмы необходимо всего 0,05 мл. а по классической методике 0,5 мл. Использование автоматических микропипеток позволяет уменьшить погрешность связанную с работой с микроколичествами реактивов и биологических материалов. Еще одним положительным моментом нашей модификации является упрощение расчетов и построения калибровочного графика и их автоматизация. Использование уравнения полиномиальной аппроксимации позволяет снизить погрешность методики связанную с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности раствора р-нитроанилина от его концентрации. В целом методика расчета более проста для понимания, чем классическая, а использование Microsoft Excel позволяет не только полностью автоматизировать расчет, но и вести базу данных.
Алехин С.А., Липатов В.А. Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях. // Материалы 66-й научной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные проблемы медицины и фармации", Курск, 2001, -с. 57 - 59. 18.05.2004
Смотрите также: Шесть видов аллергических заболеваний, Рациональная фармакотерапия гриппа и ОРВИ, Медикаментозное лечение женского бесплодия, Как лечить облысение, Лечение и профилактика острого послеоперационного панкреатита Интересные факты:
Нейроциркуляторная дистония Каждая болезнь имеет свою визитную карточку. При ишемической болезни сердца - это атеросклеротические бляшки в сосудах, при язвенной - дефект слизистой, при пневмонии - воспалительные изменения в легких. А вот нейроциркуляторная дистония - нечто неуловимое, эфемерное, летучее.
| Как выбрать диету - Прежде всего, надо сказать, что самостоятельно подбирать себе диету категорически противопоказано людям, страдающим ожирением, особенно если это заболевание осложнено такими недугами, как сахарный диабет, гипертония, ишемическая болезнь сердца. Только врач-диетолог на основе анализов способен составить такой рацион питания, при котором вес бы снижался, не ухудшая состояния здоровья больного.
| Токсический грипп Картина заболевания похожа на острый катар дыхательных путей, однако в отличие от не-го протекает с высокой температурой, сильной головной болью, слабостью и разбитостью, нередко с полуобмороч-ными состояниями.
| Болевой синдром при ревматических заболеваниях К.м.н. Ю.А. Олюнин Институт ревматологии РАМН, Москва Проблема боли и борьбы с ней, весьма актуальная для медицины в целом, имеет ключевое значение для ревматологии. Боли в области суставов или позвоночника –ведущее проявление подавляющего большинства ревматических заболеваний, основная причина нарушения трудоспособности и снижения качества жизни больных. Они могут быт
| Терапевтические возможности системной фармакотерапии дерматомикозов К.м.н. Т.А. Белоусова, М.В. Горячкина ММА имени И.М. Сеченова Грибковые заболевания кожи являются одной из наиболее часто обсуждаемых проблем на различных дерматологических форумах и на страницах научных журналов. Актуальность этой темы определяется, с одной стороны, значительной распространенностью этой патологии, на долю которой, по данным литературы, приходится от 37% до 4
|
| |
|