Яндекс.Метрика
 

   
Главная >> Медицинские статьи >> Лабораторная диагностика

Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях

Алехин С.А. Липатов В.А.
Курский государственный медицинский университет, каф. хирургических болезней № 2, каф. оперативной хирургии и топографической анатомии
www.drli.h1.ru 

Определение активности трипсина является важным критерием в диагностике острого панкреатита. До настоящего времени основным методом определения активности трипсина был метод Эрлангера в модификации Шатерникова. Недостатками данного метода является его большая стоимость, погрешность связанная с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности стандартного раствора р-нитроанилина от его концентрации используемого для построения калибровочного графика, сложность расчетов.

Целью нашей работы являлось устранение вышеизложенных недостатков существующей методики.

Нами разработан микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях.

Метод основан на расщеплении трипсином синтетиче­ского бесцветного субстрата — бензоиларгинин-р-нитроанилида — с образованием окрашенного р-нитроанилина, количество которого мы определяем на спектрофотометре BACKMAN-DU65 c микрокюветами при длине волны 410 нм.

Реактивы используемые в нашем методе такие, как и в методике Эрлангера в модификации Шатерника.

Калибровка проводится по описанной методике отличием является построение графика, которое проводится для автоматизации процесса и ведения базы данных в Microsoft Excel.

Поскольку калибровочный график не может иметь четкую линейную зависимость, то для выражения зависимости оптической плотности раствора от концентрации р-нитроанилина необходимо определить уравнение которое описывает данную график. Таким уравнением является уравнение полиномиальной аппроксимации, которое можно также вывести на калибровочный график в Microsoft Excel.

Ход определения:
В опытную и контрольную пробирку вносят по 0,4 мл бензоиларгинин-р-нитроанилида и добавляют по 0,025 мл физиологического раствора. Затем вносят по 0,025 мл плазмы крови, в контрольную пробирку сразу после этого добавляют 0,05мл 0,5н раствора НCl. 0,5 мл содержимого помещают в микрокювету и измеряют значение оптической плотности при длине волны 410 нм и обозначают это значение, как ЕК(410). Поскольку в некоторых случаях в ходе ферментативной реакции происходит помутнение раствора, для введения поправки на мутность следует определить оптическую плотность жидкости также и при длине волны 550 нм. Полученные данные помечают как ЕК(550). Далее опытную пробирку ставят в термостат при температуре 370С на 30 минут. После термостатирования определяют оптическую плотность раствора при длинах волн 410 и 550 нм в опытной пробирке и помечают полученные данные, как ЕОп(410) и ЕОп(550).

Расчет активности трипсина производят в три этапа
1. Расчет разницы оптических плотностей при разных длинах волн, она будет равна:
DЕ = (ЕОп(410) – ЕК(410)) – (ЕОп(550)- ЕК(550))

2. Расчет количества образовавшегося р-нитроанилина по полиномиальному уравнению, которое в общем виде будет выглядеть следующим образом:

y = b + c1*x + c2*x2 +……. +c6*x6 , где b и с константы

Пример полиномиального уравнения для расчета концентрации р-нитроанилина: y = 874,45*x 1 + 84,94*x2
В данном случае константа b равняется 0 и в связи с этим опущена. х - DЕ, а у – количество образовавшегося р-нитроанилина.

В каждой лаборатории должна быть проведена калибровка и расчет полиномиального уравнения для данных этой калибровки.

3. Непосредственно расчет активности трипсина.

Поскольку это микровариант методики определения трипсина, количества реактивов и плазмы крови пропорционально уменьшены по отношению к классической методике, то и коэффициенты перерасчета будут теми же, что и в классической методике.

Количество р-нитроанилина высчитанное с помощью полиномиального уравнения, показывает сколько вещества образовалось в ходе ферментативной реакции в 0,5 мл субстрата в течение 30 минут при добавлении 0,025 плазмы, а высчитываемое количество трипсина в единицах активности показывает сколько вещества образуется в 0,5 мл субстрата при добавлении 0,1 мл плазмы за 1минуту.

Следовательно А – количество трипсина в единицах активности будет равно: А = (у * 4) / 30.
Таким образом расчет активности трипсина по данной методике значительно снижает расход реактивов (в 10 раз по сравнению с методикой Эрлангера в модификации Шатерникова) очевидна экономическая эффективность первой из них. В связи с отсутствием принципиальных отличий между двумя методиками, результаты измерений активности трипсина будут аналогичными (разница между результатами будет находится в области погрешности методики). Немаловажным является и снижение количества забираемой крови на исследование. Так по предложенной нами методике плазмы необходимо всего 0,05 мл. а по классической методике 0,5 мл. Использование автоматических микропипеток позволяет уменьшить погрешность связанную с работой с микроколичествами реактивов и биологических материалов. Еще одним положительным моментом нашей модификации является упрощение расчетов и построения калибровочного графика и их автоматизация.
Использование уравнения полиномиальной аппроксимации позволяет снизить погрешность методики связанную с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности раствора р-нитроанилина от его концентрации. В целом методика расчета более проста для понимания, чем классическая, а использование Microsoft Excel позволяет не только полностью автоматизировать расчет, но и вести базу данных.

Алехин С.А., Липатов В.А. Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях. // Материалы 66-й научной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные проблемы медицины и фармации", Курск, 2001, -с. 57 - 59.
18.05.2004

Смотрите также:
Шесть видов аллергических заболеваний,   Рациональная фармакотерапия гриппа и ОРВИ,   Медикаментозное лечение женского бесплодия,   Как лечить облысение,   Лечение и профилактика острого послеоперационного панкреатита
Интересные факты:
Нейроциркуляторная дистония
Каждая болезнь имеет свою визитную карточку. При ишемической болезни сердца - это атеросклеротические бляшки в сосудах, при язвенной - дефект слизистой, при пневмонии - воспалительные изменения в легких. А вот нейроциркуляторная дистония - нечто неуловимое, эфемерное, летучее.
Как выбрать диету
- Прежде всего, надо сказать, что самостоятельно подбирать себе диету категорически противопоказано людям, страдающим ожирением, особенно если это заболевание осложнено такими недугами, как сахарный диабет, гипертония, ишемическая болезнь сердца. Только врач-диетолог на основе анализов способен составить такой рацион питания, при котором вес бы снижался, не ухудшая состояния здоровья больного.
Токсический грипп
Картина заболевания похожа на острый катар дыхательных путей, однако в отличие от не-го протекает с высокой температурой, сильной головной болью, слабостью и разбитостью, нередко с полуобмороч-ными состояниями.
Болевой синдром при ревматических заболеваниях
К.м.н. Ю.А. Олюнин Институт ревматологии РАМН, Москва Проблема боли и борьбы с ней, весьма актуальная для медицины в целом, имеет ключевое значение для ревматологии. Боли в области суставов или позвоночника –ведущее проявление подавляющего большинства ревматических заболеваний, основная причина нарушения трудоспособности и снижения качества жизни больных. Они могут быт
Терапевтические возможности системной фармакотерапии дерматомикозов
К.м.н. Т.А. Белоусова, М.В. Горячкина ММА имени И.М. Сеченова Грибковые заболевания кожи являются одной из наиболее часто обсуждаемых проблем на различных дерматологических форумах и на страницах научных журналов. Актуальность этой темы определяется, с одной стороны, значительной распространенностью этой патологии, на долю которой, по данным литературы, приходится от 37% до 4

 


© 2005-2017 www.medband.ru, написать письмо
Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях
Медицина от А до Я. Заболевания. Симптомы.
Rambler's Top100