|

|
|
 | |
Главная >> Медицинские статьи >> Лабораторная диагностика
Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостяхАлехин С.А. Липатов В.А. Курский государственный медицинский университет, каф. хирургических болезней № 2, каф. оперативной хирургии и топографической анатомии www.drli.h1.ru
Определение активности трипсина является важным критерием в диагностике острого панкреатита. До настоящего времени основным методом определения активности трипсина был метод Эрлангера в модификации Шатерникова. Недостатками данного метода является его большая стоимость, погрешность связанная с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности стандартного раствора р-нитроанилина от его концентрации используемого для построения калибровочного графика, сложность расчетов.
Целью нашей работы являлось устранение вышеизложенных недостатков существующей методики.
Нами разработан микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях.
Метод основан на расщеплении трипсином синтетического бесцветного субстрата — бензоиларгинин-р-нитроанилида — с образованием окрашенного р-нитроанилина, количество которого мы определяем на спектрофотометре BACKMAN-DU65 c микрокюветами при длине волны 410 нм.
Реактивы используемые в нашем методе такие, как и в методике Эрлангера в модификации Шатерника.
Калибровка проводится по описанной методике отличием является построение графика, которое проводится для автоматизации процесса и ведения базы данных в Microsoft Excel.
Поскольку калибровочный график не может иметь четкую линейную зависимость, то для выражения зависимости оптической плотности раствора от концентрации р-нитроанилина необходимо определить уравнение которое описывает данную график. Таким уравнением является уравнение полиномиальной аппроксимации, которое можно также вывести на калибровочный график в Microsoft Excel.
Ход определения: В опытную и контрольную пробирку вносят по 0,4 мл бензоиларгинин-р-нитроанилида и добавляют по 0,025 мл физиологического раствора. Затем вносят по 0,025 мл плазмы крови, в контрольную пробирку сразу после этого добавляют 0,05мл 0,5н раствора НCl. 0,5 мл содержимого помещают в микрокювету и измеряют значение оптической плотности при длине волны 410 нм и обозначают это значение, как ЕК(410). Поскольку в некоторых случаях в ходе ферментативной реакции происходит помутнение раствора, для введения поправки на мутность следует определить оптическую плотность жидкости также и при длине волны 550 нм. Полученные данные помечают как ЕК(550). Далее опытную пробирку ставят в термостат при температуре 370С на 30 минут. После термостатирования определяют оптическую плотность раствора при длинах волн 410 и 550 нм в опытной пробирке и помечают полученные данные, как ЕОп(410) и ЕОп(550).
Расчет активности трипсина производят в три этапа 1. Расчет разницы оптических плотностей при разных длинах волн, она будет равна: DЕ = (ЕОп(410) – ЕК(410)) – (ЕОп(550)- ЕК(550))
2. Расчет количества образовавшегося р-нитроанилина по полиномиальному уравнению, которое в общем виде будет выглядеть следующим образом:
y = b + c1*x + c2*x2 +……. +c6*x6 , где b и с константы
Пример полиномиального уравнения для расчета концентрации р-нитроанилина: y = 874,45*x 1 + 84,94*x2 В данном случае константа b равняется 0 и в связи с этим опущена. х - DЕ, а у – количество образовавшегося р-нитроанилина.
В каждой лаборатории должна быть проведена калибровка и расчет полиномиального уравнения для данных этой калибровки.
3. Непосредственно расчет активности трипсина.
Поскольку это микровариант методики определения трипсина, количества реактивов и плазмы крови пропорционально уменьшены по отношению к классической методике, то и коэффициенты перерасчета будут теми же, что и в классической методике.
Количество р-нитроанилина высчитанное с помощью полиномиального уравнения, показывает сколько вещества образовалось в ходе ферментативной реакции в 0,5 мл субстрата в течение 30 минут при добавлении 0,025 плазмы, а высчитываемое количество трипсина в единицах активности показывает сколько вещества образуется в 0,5 мл субстрата при добавлении 0,1 мл плазмы за 1минуту.
Следовательно А – количество трипсина в единицах активности будет равно: А = (у * 4) / 30. Таким образом расчет активности трипсина по данной методике значительно снижает расход реактивов (в 10 раз по сравнению с методикой Эрлангера в модификации Шатерникова) очевидна экономическая эффективность первой из них. В связи с отсутствием принципиальных отличий между двумя методиками, результаты измерений активности трипсина будут аналогичными (разница между результатами будет находится в области погрешности методики). Немаловажным является и снижение количества забираемой крови на исследование. Так по предложенной нами методике плазмы необходимо всего 0,05 мл. а по классической методике 0,5 мл. Использование автоматических микропипеток позволяет уменьшить погрешность связанную с работой с микроколичествами реактивов и биологических материалов. Еще одним положительным моментом нашей модификации является упрощение расчетов и построения калибровочного графика и их автоматизация. Использование уравнения полиномиальной аппроксимации позволяет снизить погрешность методики связанную с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности раствора р-нитроанилина от его концентрации. В целом методика расчета более проста для понимания, чем классическая, а использование Microsoft Excel позволяет не только полностью автоматизировать расчет, но и вести базу данных.
Алехин С.А., Липатов В.А. Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях. // Материалы 66-й научной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные проблемы медицины и фармации", Курск, 2001, -с. 57 - 59. 18.05.2004
Смотрите также: Выбор АБ терапии при внебольничных пневмониях, Качество и безопасность изделий медицинского назначения однократного применения, стерилизуемых радиационным способом, Диета по группе крови, Патогенетическое обоснование локальной терапии при ревматических заболеваниях, СПИД. Проявление ВИЧ-инфекции в полости рта Интересные факты:
Гипотоник на зарядке Нарушения кровообращения при пониженном артериальном давлении менее опасны, чем при повышенном. Однако сопровождающие их состояния (например, головокружение или упадок сил) очень неприятны и, кроме того, снижают уровень физической и умственной работоспособности. В то время как артериальная гипертония отмечается, как правило, у людей среднего возраста и пожилых людей, артериальная гипотония свойст
| Значение цитокинов в патогенезе воспалительных заболеваний толстой кишки у детей С.В. Бельмер, А.С. Симбирцев, О.В. Головенко, Л.В. Бубнова, Л.М. Карпина, Н.Е. Щиголева, Т.Л. Михайлова
| Ох, уж эти кастрюльки со сковородками... Как и почему я стал сыроедом Александр Чупрун Около 30 лет назад я занялся исследованием различных аспектов сыроедения, в том числе и на собственном опыте. Меня и раньше занимала проблема пищевых предпочтений, привычек и пристрастий в питании. Очень хотелось выяснить: почему трудно победить привычку к употреблению нездоровой, денатурированной пищи?
| Сергей Выгонский: психиатрия недооценивает интернет-зависимость Психиатр Сергей Выгонский считает, что общество до сих пор в полной мере не осознало, насколько влияет Интернет на его развитие, что юзеры — носители парадоксального мышления, а веб-сёрфинг – это разновидность медитации.
| Атеросклероз Панчук С.Н. Медико-социальная значимость атеросклероза Первичная артериальная гипертензия (гипертоническая болезнь), острые (инфаркт, инсульт) и хронические (ишемическая болезнь сердца, хроническое нарушение мозгового кровообращения) заболевания сосудов сердца и мозга, поражение артерий нижних конечностей, расслаивающаяся аневризма аорты, сахарный диабет 2 типа … - это далеко не
|
| |
|